Introducción

El presente trabajo trata de dar un pantallazo general sobre los usos y cuidados que se deben tener a la hora de la obtención de muestras para el posterior estudio de tipificación de DNA (por sus siglas inglesas, como se lo encuentra en la bibliografía de todo el mundo). Vale aclarar que es un trabajo sobre la base de información recopilada de diferentes profesionales internacionales como se verá en la bibliografía citada. El nivel que se maneja a lo largo del presente trabajo es de pregrado para la investigación posterior y pronfundización sobre el tema. Dada la poca información nacional con que se cuenta, o por lo menos a la que se tiene acceso en el interior, es que se consultó en distintas páginas webs (internet) sobre experiencias de catedráticos de Colombia, España y Estados Unidos.

Ante la necesidad que hay de conocer el tema diariamente en la sociedad y la deficiente información vertida por los medios periodísticos nacionales, donde se habla de la tipificación de DNA, sumado a la falta de bibliografía actualizada al alcance de los alumnos, se dividió el presente trabajo en dos partes. Por un lado se hace una revisión de la normalidad de los componentes celulares implicados en el tema con exaltación en negrillas de las palabras clave para tener en cuenta posteriormente. Y por otro lado una segunda parte con la tipificación del DNA, usos, cuidados y normativa a la hora de recolectar, conservar las pruebas, y fundamentalmente qué resultados esperar de esta prueba sumamente sofisticada.

Palabras clave

DNA repetitivo. Nucleótidos. Nucleósidos. Locus. Loci. Alelos.

Primera parte

El DNA es uno de los dos ácidos nucleicos que se encuentran en las células de los organismos vivientes. Se encuentra en el núcleo celular formando parte de los cromosomas y en el citoplasma lo hallaremos dentro de las mitocondrias, en el caso de las células vegetales, también está en los cloroplastos.

Aquí se nombra también al RNA, por formar parte de un sistema conjunto para la codificación de proteínas, que es la principal causa de existencia de ambos. El RNA está en el núcleo citoplasmático, donde es creado por traducción desde el DNA, y en el citoplasma, donde codifica la síntesis de proteínas.

Estructura química

Los ácidos nucleicos están formados por un azúcar (pentosa), bases nitrogenadas (purinas y pirimidinas) y ácido fosfórico. En el caso de DNA la pentosa es la desoxirribosa, y el RNA tiene ribosa.

Las bases púricas son iguales para DNA y para RNA, son Adenina y Guanina, y las bases pirimídicas para el primero son Citosina y Timidina y en el RNA cambia la Timidina por Uracilo.

Los nucleótidos son las unidades monoméricas de la macromolécula de ácido nucleico, que resultan de la unión covalente de un fosfato y una base heterocíclica con la pentosa. Dentro del nucleótido, la combinación de una base con la pentosa constituye un nucleósido. Por ejemplo, la adenina es una base púrica, la adenosina (adenina+ribosa) es el nucleósido correspondiente, y el adenosinmonofosfato (AMP) es el nucleótido.

Adenina	Base púrica
Adenosina	Nucleósido
Adenosina-5-fosfato (AMP)	Nucleótido

En las células eucariontes,el DNA está asociado con histonas (proteínas básicas ricas en arginina o lisina) y constituye un complejo de nucleoproteína, llamado cromatina.

El ácido nucleico formado por diferentes nucleótidos altenados dentro de las cuatro variantes mencionadas y en forma lineal, en una doble cadena helicoidal, codifica para la producción de proteínas o polipeptidos, como se comprenderá más adelante.

Introducción en la ingeniería genética

Genes. La genética molecular tuvo un paso fundamental en 1948, cuando Beadle y Tatum enunciaron la hiótesis: un gen, una enzima. En la versión moderna se comprobó que una enzima puede estar formada por varios polipéptidos, entonces sería: un gen, una cadena polipeptídica. También se debe tener en cuenta que no todos los genes codifican proteínas.

Los genes se encuentran de a pares, denominados alelos. En cada cromosoma homólogo existe un gen en un lugar particular, el locus (plural loci).

El Codón es la unidad hereditaria que contiene la información para codificar un aminoácido. Está formado por tres nucleótidos, triplete.

Código genético

El código se lee en grupos de tres bases. El triplete es el número menor de bases (nucleótidos) capaz de codificar los aminoácidos. Al ser el número posible de codones 64, es adecuado para codificar los 20 aminoáciodos que constituyen los polipeptidos del organismo.

La longitud del gen está relacionada con el número de aminoácidos en el polipeptido. Ejemplo: 1500 necleótidos o 500 codones para 500 aminoácidos.

Una de las conclusiones más importantes que pueden extraerse en los estudios sobre diferenciación celular es que la mayoría del DNA no se transcribe. Deferenciandose heterocromatina y eucromatina, la primera se mantiene condensada en las divisiones celulares, y no transcribe RNAm. La eucromatina se pone laxa durante la división celular, se duplica en ella y también transcribe RNAm en diferentes momentos del metabolismo y función celular en cada órgano.

De lo anterior se caracteriza que la presencia de DNA repetitivo, también llamado DNA no codificante, es propia de los eucariontes, desde protozoarios hasta células superiores de animales y vegetales. Esto no pasa con los virus ni con las bacterias (organismos procariontes), donde hay muy poco DNA repetitivo. Los DNA más altamente repetitivos se denominan DNAs-satélites, porque con frecuencia pueden segregarse de la masa del DNA por centrifugación en cloruro de cesio. En la actualidad la función de esta parte del DNA es desconocida, pero también se sabe que no guarda información genética y juega un importante papel en la estructura y función de los cromosomas. También actúa como puntos calientes en el crossing-over (recombinación o intercambio de material genético, base de la herencia) durante lameiosis.

Este ADN puede ser de dos tipos:

ADN espaciador. Está formado por bases en una secuencia sencilla que está entre regiones codificantes del genoma;

ADN repetitivo, que lo forma una secuencia que, al contrario que el espaciador, se dispone por todo el genoma, debido a la existencia de múltiples copias. A su vez este ADN repetitivo se divide según las características de la secuencia en «Secuencias repetidas en tándem«, en las que existe una secuencia común relativamente corta que se repite en tándem de manera continua (una tras otra) en un fragmento de ADN

— ATCG G ATCG G ATCG G ATCG G ATCG G —-

y «Secuencias repetidas intercaladas«, tratándose de una secuencia larga de bases que aparece repetida, pero no a continuación del primer grupo de secuencia repetitivo, sino en un lugar diferente y distante del genoma:

–ATC CCC GGG AAT CGA TAA ACG GAT C——ATC CCC GGG AAT CGA TAA ACG GAT C —

Las características generales del ADN no codificante lo hacen especialmente útil para su aplicación a la identificación forense. Como se puede deducir de su trascendente función, el ADN esencial está formado por secuencias altamente conservadas con muy pocas variaciones interindividuales e intergeneracionales, ya que de lo contrario se podrían ver afectadas funciones básicas para la vida de las personas. Los mínimos cambios que tienen lugar, cuando son viables, aumentan el polimorfismo de proteínas y enzimas, aunque también pueden tener efectos negativos.

Por el contrario, el ADN no codificante presenta una gran variabilidad de unos individuos a otros, ya que estas secuencia no son conservadoras al no afectar sus cambios a la fisiología normal del individuo. Las variaciones debidas a cambios de bases sencillos, procesos de inserción-delección o de intercambio de DNA (recombinación) durante la formación de las células germinales (meiosis), hacen que se modifiquen el número de repeticiones o el orden de las bases de un determinado fragmento repetitivo, pudiendo producirse en un locus sencillo o en múltiples loci, siendo este el origen de la variación que hace que no haya dos personas, a excepción de los gemelos univitelinos, que tengan la misma secuencia del ADN.

Segunda parte

Hasta aquí llegamos explicando lo que pasa en una célula normal, el estudio del DNA en el núcleo, y hago hincapié en ciertos términos importantes para poder entender de qué manera el estudio de algo tan complicado en la biología molecular sirva tanto para el diagnóstico de la paternidad, como para la identificación criminalistica. También debo aclarar en esta parte que es la específica de este trabajo, que no se debe dejar de lado desde ningún punto de vista lo básico como son el lugar del hecho, las características propias a cada caso, y no olvidar lo que decían los grandes maestros argentinos, Nerio Rojas, Achával, Bonnet. Pero en ciertos casos y con la violencia que nos invade día a día no queda otra forma de indentificar por medio de restos que muchas veces en otros tiempos no eran más que simples manchas o artefactos inservibles.

Recuperación y limpieza del material

Lo esencial en la recuperación del material es minimizar la contaminación de las muestras con DNA extraño. Se debe poner especial cuidado con cada elemento que se encuentre en el lugar del hecho, y las personas que llegan primero al mismo, gotas de sudor, sangre, saliva, células epiteliales o cabellos de todos los que analizan el sitio o llegaron a él, deben tener total cuidado, porque pueden ser agentes contaminantes e invalidar las pruebas o los resultados devueltos por los laboratorios.

Por elemental que parezca, no debemos olvidar nunca que los laboratorios sólo estudian aquello que se remite, y que el análisis se inicia sobre el indicio en las condiciones en las que llega, no en las que se manda; de ahí la enorme importancia del indicio en el lugar de los hechos.

Durante la recolección, conservación y envío, debe evitarse la contaminación, ya que cualquier material orgánico procedente de los manipuladores o ruptura de la cadena de frío puede imposibilitar el estudio.

Normas generales

En este sentido deben seguirse las siguientes normas generales:

1.- Procurar condiciones de máxima esterilidad, usando guantes de goma -si se entra en la escena del crimen- e instrumentos esterilizados o adecuadamente limpiados para la obtención de materiales (pinzas, tijeras etc.).

2.- Volver a limpiar o utilizar un nuevo instrumento para recoger un indicio diferente. Si se recoge con guantes, cambiar los mismos si se recoge un elemento diferente.

3.- Usar diferentes recipientes para cada indicio, aunque hayan sido recogidos en lugares muy próximos o estuviesen juntos.

4.- Etiquetar perfectamente cada uno de los recipientes haciendo referencia a:

1. fecha y hora;
2. identificación de la víctima;
3. localización del indicio;
4. tipo de indicio;
5. número del mismo;
6. nombre de la persona que lo recoge;
7. referencia al caso judicial.

5.- Enviar lo más rápidamente posible al Juzgado o laboratorio, asegurando que si hay muestras con cadena de frío, esta se mantenga.

6.- Es fundamental y básico tomar muestras testigo de la víctima y sospechoso. De ser posible extrayéndole sangre, o en su defecto con frotis de la cavidad bucal (siempre con autorización de la persona implicada).

7.- Tomar la filiación de todas las personas que han intervenido o colaborado en la recogida de las evidencias por si se produce algún problema de contaminación cruzada.

Normas generales en casos especiales

Estas normas generales se completarán con aquellas que son específicas a determinados vestigios orgánicos y a su forma de presentación.

Indicios líquidos. Se deben recoger con una jeringa estéril; la sangre debe mantenerse anticoagulada con EDTA, pero sirve con cualquier otro producto. También se pueden utilizar algodón, gasa, o hisopos estériles, para la recolección, dejándolos secar antes de almacenar.

Indicios húmedos. Se debe dejarlos secar a temperatura ambiente, sin aplicar ninguna fuente de calor. No deben guardarse en estado húmedo, ya que la humedad favorece el crecimiento de bacterias y hongos que puede afectar a la calidad del indicio (las enzimas restrictoras pueden degradar el DNA de los microorganismos).

Manchas secas. Las podemos encontrar sobre objetos transportables (cuchillo, bolígrafo, armas, elementos de limpieza, etc.) o sobre objetos no transportables (muebles, paredes, sanitarios, etc.). Dentro de los primeros debemos incluir aquellos que se pueden cortar (cortinas, alfombras, etc.). En el caso de que se puedan transportar enviaremos el objeto o el trozo cortado del mismo, excepto si se trata de alguna prenda de vestir que la remitiremos sin cortar. Cuando el objeto no es transportable (suelo, muebles,) procederemos a raspar la mancha con un instrumento estéril o lo mas limpio, depositando el raspado en un papel de similares caracteres, que se doblará e introducirá en un recipiente hermético limpio para mantener el indicio. En el caso de que se localicen pequeñas gotas, como consecuencia de salpicaduras, se debe raspar o tratar de recuperarlas aplicando sobre ellas una cinta adhesiva.

Restos sólidos. Con la misma precaución, procederemos a su recolección y almacenamiento. Cuando sean antiguos podremos tomarlos directamente usando guantes, pero sin son recientes, frágiles o maleables debemos usar pinzas.

Pelos. Siempre se mantendrá el cuidado que las normas generales aconsejan, debiendo ser recogidos con pinzas. Debe evitarse un fallo muy frecuente al manejar pelos, ya que hay que almacenar cada pelo en un recipiente diferente, pese a que aparezcan todos juntos e incluso parezcan, macroscópicamente, proceder de una misma persona.

Un tema aparte los representan los huesos en casos antiguos o identificación de restos con varios años o meses en cualquier medio, agua, tierra o sales de determinados terrenos. También se hace incapié en dos casos que nos tocan muy de cerca por un lado restos de fosas comunes. En nuestro país luego del último proceso de reorganización nacional. Y un caso especial como fue el último accidente del avión de Lapa en el aeropuesto Jorge Newbery de Capital Federal.

Huesos. Deben ser manipulados con guantes de cirugía para evitar la contaminación con células epitaliales o sudor, como se dijo previamente. En lo posible trabajar con los huesos recientemente desenterrados, sin lavar. El lavado, el secado y posterior almacenamiento estando húmedo puede enmohecerlo y acelerar el proceso de degradación. El exceso de tierra o ceniza se elimina con escalpelo y el hueso se limpia en un chorro abrasivo de arena fresca de óxido de aluminio. Posteriormente, se elimina el polvo del hueso y el óxido de aluminio del hueso limpio utilizando una brocha suave (Hagelberg y Clegg, 1991: 45-46).

Una vez recogido el indicio debe conservarse en frío (+4ºC) o congelarlo a la mínima temperatura posible. Se debe tener en cuenta que al conservar de esta manera, muy posiblemente se invalide las muestras para otros análisis diferentes a la identificación de DNA.

Quimica de indentificación

Tipificación del DNA

El método de tipificación del DNA desarrollado en 1983 por el profesor de la Universidad de Leicester, Alec J. Jeffreys, se basa en la metodología con la que se estudia patologías hereditarias, identificando genes causantes de enfermedades en familias portadoras de un trastorno congénito.

Comparativamente con la eficiencia de los marcadores de proteínas, en la identificación forense la tipificación del DNA posee dos ventajas:

1. puede utilizarse en el análisis de muestras pequeñas y antiguas;
2. su nivel de certeza de probabilidad es triple a cuádruple que la anterior.

Determinación

Para determinar si dos muestras de DNA poseen el mismo origen, se examinan las regiones variables de los pares de bases del DNA. Estas regiones pueden segmentarse mediante enzimas de restricción y se las denomina RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms).

Para la identificación del DNA se requiere que los RFLP sean altamente variables, es decir, polimórficos, con un gran número de variantes o locus en la población. Algunas regiones del DNA humano contienen secuencias centrales que se repiten variablemente en cada individuo y por tanto, cuando las enzimas de restricción cortan el DNA en millones de piezas, así también varía la longitud de los fragmentos. Mediante la introducción de sondas que se enlazan solamente con los fragmentos que portan la secuencia central se aíslan los fragmentos variables de los irrelevantes.

Los laboratorios forenses utilizan tres métodos distintos de tipificación del DNA:

1- Hibridación con sondas. Básicamente consiste en la identificación de una región determinada mediante el uso de una sonda, que es un fragmento monocatenario de DNA complementario a una secuencia de bases conocida. Esta sonda, marcada con un producto radiactivo o quimioluminescente, se pone en la solución con el DNA de la muestra y se visualiza después de una serie de procesos para separar los diferentes alelos que puedan existir con base en la longitud de los mismos.

2- Secuenciación. Las técnicas de este grupo van destinadas a revelar el orden de la secuencia de bases de una determinada región, normalmente delimitada previamente por PCR. Puede hacerse de forma manual o automática. En Medicina Forense se aplica, fundamentalmente, para el análisis del DNA mitocondrial por sus especiales características.

3- Reacción en cadena de la polimeras (PCR). Esta técnica supuso una verdadera revolución y es la más extendida en la actualidad, por sí sola o como paso intermedio de la secuenciación. Inventada por Kary Mullis en 1987, le supuso el premio Nobel de Química. Es un instrumento de análisis óptimo, puesto que permite amplificar un pequeño número de moléculas intactas de DNA antiguo que está delimitada por una secuencia específica y complementaria a unas pequeñas sondas denominadas primers que actúan como iniciadores de la reacción de polimerización que lleva a cabo una enzima, habitualmente la Taq-polimerasa. Esta enzima va uniendo desoxinucleótidos, que se incluyen en la reacción, de forma complementaria a cada una de los fragmentos de las cadenas que se delimitan por los primers que se los toma como moldes. La repetición cíclica de este proceso permite la obtención de múltiples copias de dicha región en una cantidad suficiente para ser estudiada. Posteriormente, el DNA amplificado se puede visualizar mediante la separación de los alelos de diferente tamaño y tinción o estudiando las variaciones de su secuencia. De este modo es posible que cuando dispongamos de muy escasa cantidad de DNA en un indicio o esté parcialmene degradado, sea posible amplificarlo y obtener una cantidad suficiente para su análisis.

Para determinar si dos muestras de DNA poseen el mismo origen, se examinan las bandas identificadas por una sonda concreta en el autorradiógrafo y se comprueba su nivel de coincidencia. Los resultados se confrontan con la información existente sobre la caracterización genética de cada población para averiguar la frecuencia de aparición del tamaño de ese alelo en particular. Al considerar los alelos de varios sitios distintos disminuye la posibilidad de coincidencia de dos o más individuos. La posibilidad de que cualesquiera personas puedan tener la misma huella dactilar de DNA es de 1 entre 10.000-30.000 millones.

Todo lo anterior nos lleva a destacar dos grandes aspectos de la investigación del ADN en nuestra especialidad:

1.- Se trata de ADN no codificante, es decir, que la información obtenida tras su análisis no nos puede aportar nada sobre ninguna de las características fenotípicas del individuo. No obstante, conforme van avanzando las investigaciones sobre el Proyecto Genoma Humano se van descubriendo que parte del ADN no codificante está relacionado con alguna característica fenotípica, bien de tipo fisiológico o bien patológico (enfermedades). En cualquier caso en la mayoría de los casos la información es poco significativa desde el punto de vista práctico, tratándose más de un interés científico.

2.- Al igual que en tantos otros métodos de identificación médico-forense, es necesario llevar a cabo una comparación entre el perfil genético obtenido del indicio o muestra y el genotipo de un individuo o evidencia orgánica.

Problemas más comunes con los indicios

Criterios de autenticidad

El principal criterio que se debe tener en cuenta es el filogenético. Si la muestra se contaminó con material genético de flora y fauna animal se puede detectar su autenticidad mediante la inspección de las secuencias con especies afines relacionadas. En segundo lugar, el tamaño del producto amplificado puede servir como un criterio adicional de autenticidad. Recientemente se ha comprobado que no es posible amplificar fragmentos de DNA antiguo más allá de 150 bp (base-pair), aunque un hueso bien conservado puede ampliar hasta 500 bp. Estudios realizados en tejido momificado egipcio demuestran que el DNA antiguo se puede conservar en una forma clonable y que tanto el DNA nuclear como el mitocondrial pueden persistir durante varios milenios.

Detección de fuentes de contaminación

Con el fin de detectar cualquier fuente de contaminación se deben tomar algunas medidas de precaución.

1. Realizar extractos de control en paralelo obtenidos de especímenes antiguos, para detectar contaminación en las soluciones y reactivos.
2. Preparar varios extractos independientes de cada individuo y comparar la identidad y la ausencia de ambigüedad en las sencuencias.
3. En virtud de la fuerte correlación inversa entre la eficiencia de la amplificación y el tamaño del producto amplificado observado en el DNA antiguo pero no en el moderno, el tamaño del DNA amplificado puede servir como un criterio adicional de detección de contaminación. Secuencias superiores a 500 bp prueban invariablemente que la muestra se contaminó con DNA de especímenes modernos.

Errores producidos por cambios post mortem

Habitualmente no se espera que predominen los errores específicos producidos por cambios post morten en una población amplificada de moléculas. Si llegan a predominar y a causar secuencias incorrectas, el patrón de sustitución puede afectarse en un sentido predecible. Las sustituciones pueden estar distribuidas aleatoriamente con relación a las posiciones de los codones, de hecho, no obstante, el índice de cambios silenciosos a cambios por remplazo al azar pueden ser de 2 a 8.

Secuencias en mosaico vía PCR saltarín

El PCR saltarín es una propiedad adicional que puede afectar la autenticidad de las sencuencias amplificadas. Si las moléculas moldes no abarcan el segmento total definido por el código existente en el extracto antiguo, la amplificación puede comenzar a partir de segmentos más cortos de DNA que son complementarios a uno u otro de los códigos (primers). Esos fragmentos sirven como moldes en la primera extensión y los códigos parcialmente extendidos pueden ser extendidos en el siguiente ciclo después de hibridarse con otros fragmentos de la región que es amplificada. En el caso de genes cromosómicos de individuos heterocigóticos el PCR saltarín puede generar secuencias erróneas que resultan de la recombinación durante la amplificación.

Presentación de las pruebas

Para que un test forense sea admitido como prueba, ha de cumplir tres condiciones:

1. Que la teoría científica en cuestión sea considerada válida por la comunidad científica;
2. La fiabilidad de la prueba debe ser reconocida;
3. Debe demostrarse que ésta se aplicó adecuadamente en el caso concreto.

En Estados Unidos se ha utilizado la prueba de DNA en más de 1.000 casos criminales, pero sólo en unas decenas de casos se le ha cuestionado en audiencias preprocesales. El poder de la identificación forense por DNA radica precisamente, no sólo en la capacidad de demostrar que dos muestras exhiben el mismo patrón, sino también para sugerir que el patrón es rarísimo. En este sentido, la validez de losdatos y las hipótesis sobre las que se han basado los laboratorios forenses para estimar la rareza son objeto de debate entre la comunidad científica.

Los mayores problemas en la utilización de las pruebas de DNA radican:

1. En los precios de las pruebas. Sus altos costos, la necesidad de recurrir a laboratorios competentes y en el exterior, los escasos recursos que en los tribunales se asigna a las pruebas periciales y la baja condición socioeconómica de los acusados en su mayoría dificultan su utilización.
2. Para que la prueba tenga una alta confiabilidad se requiere conocer el genoma de la población comparativa. Un estudio de esta magnitud cuesta varios millones de dólares.
3. La incorrecta manipulación de las muestras y las condiciones mismas de su degradación dificultan su utilización.

Por último, la aceptación de estas pruebas depende del conocimiento y características básicas de los test de DNA por parte fiscales, jueces y abogados, para no ser rebasados por la complejidad del tema. En la medida en que se superen estas dificultades, con una regulación y adecuada estructuración de laboratorios forenses, la nueva técnica de tipificación del DNA cumplirá un importante papel en el mejoramiento de las pruebas periciales, base de la justicia moderna.

Presentación fotográfica

Como ejemplo de lo que finalmente sería la prueba presentada en base a las muestras analizadas en los laboratorios especializados, trataremos de mostrar la interpretación con una fotografía.

La misma muestra en el centro la principal muestra de sangre en el lugar primario del hecho. Se continúo con la tipificación de DNA con muestras sanguíneas de siete sospechosos. Comparativamente similar a al indicio primario es la muestra número 3.

Conclusión

Fundamentalmente hay que aclarar que la tipificación por DNA no está fuera de alcance ni es una cosa de otro mundo, con el avance tecnológico, cada vez se utilizará más. Por otro lado, se debe tener en cuenta el exquisito cuidado a la hora de la obtención de las pruebas. También se debe considerar que no siempre es aceptado como prueba irrefutable. Pero un buen examen basándose en lo clásico, con la ayuda de todas las ramas de la Medicina Forense, y sin necesidad de darle más valor del que realmente tiene a esta prueba, y a los avances que seguramente vendrán, se puede llegar a una identificación de los causantes, en el caso de crímenes, a la identificación de víctimas casi con un 99 % de positividad.

Tomando a BERTILLON, se puede afirmar que «sólo se recoge lo que se ve, y sólo se ve lo que se tiene en la mente», lo cual exige una formación y conocimiento adecuado del trabajo por realizar.

Arrieta, Segundo Germán

Facultad de Medicina

Universidad Nacional de Tucumán

República Argentina

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